מה זה קריספר (CRISPR)? מדריך למתחילים

[פוסט אורח של דביר (melquiadess), מגיב קבוע בבלוג. הוא ניסה להסביר לי מה זה קריספר, כי אני לחלוטין הלכתי לאיבוד עם כל ההסברים במקומות אחרים. ההסבר שלו היה כל כך טוב שיצא מזה פוסט]

סיפרו לכם כבר שקריספר (CRISPR) היא מילת הבאז הכי חמה בביולוגיה? לוחשים שכוחות הפלא של קריספר יכולים לרפא מחלות, ליצור תינוקות מעוצבים לעשירים או להתחיל את מגפת הזומבים (תבחרו את סוג האפוקליפסה האהוב עליכם).

יש בסיפור של קריספר באמת פריחה טכנולוגית מטורפת; כל שנה מופיעות אפליקציות וגרסאות נוספות למערכת. יש בקריספר גם מאבק איתנים בין הכוחות הכי גדולים באקדמיה, בין הארוורד ו-MIT בבוסטון מצד אחד, מול ברקלי בקליפורניה מצד שני. זה מאבק על כבוד, יוקרה, פטנטים והרבה כסף.

אני אגש לסיפור של קריספר דווקא דרך הזווית ההיסטורית. הסיפור היפה של גילוי הטכנולוגיה מראה איך מחקר מדעי בסיסי מוביל לפריצת דרך משמעותית.

[מקור, CC]

שיעור ביולוגיה קצר למתחילים (סליחה)
– חלבון: מולקולה מורכבת שמשמשת לביצוע פעולות בתא.

חלבון מורכב מרצף חומצות אמינו (ישנן 20 חומצות שונות כאלה). השימוש של כל חלבון נקבע על ידי רצף החומצות והמבנה התלת מימדי שלו. רצף החומצות של כל חלבון מקודד במידע הגנטי השמור ב-DNA.

– DNA: מולקולה ארוכה שמאחסנת את כל המידע הגנטי של אורגניזם. זה אומר שיש שם את כל ההוראות לאיזה חלבונים לייצר, מתי, וכמה.

ביצורים רב תאיים (כמו בני אדם), יש בכל אחד  מהתאים עותק זהה של ה-DNA. ניתן לתאר את ה-DNA כרצף ארוך המורכב מהאותיות "A,C,G,T". לאותיות האלה קוראים "חומצות בסיס" – או בקיצור  – "בסיסים".

– RNA: מולקולה קצרה יותר – ופחות יציבה מה-DNA  – שהיא בעצם עותק של מקטע ב-DNA.

למה צריך RNA? בדרך כלל בשביל מעבר בין ה-DNA לבין החלבון אליו המקטע מקודד. אפשר להשתמש באנלוגיה ממחשבים: ה-DNA הוא הדיסק הקשיח שמאחסן את הנתונים לאורך זמן; ה-RNA הוא הזכרון הפנימי שמשמש להרצת תוכניות.

בנוסף, יש גם סוגים של RNA אשר מבצעים פעולות בתא בעצמם בדומה לחלבונים.

– גן: יחידת מידע (שמקודדת ב-DNA). הגן מאחסן את ההוראות לייצור חלבון מסוג אחד. (זה לא הכי מדוייק, וקיים ויכוח על ההגדרה המדוייקת של גן. אבל לצורך הפוסט הזה ההגדרה הזו מספקת)

מה זה בכלל קריספר?
בהגדרה המקורית, קריספר היא טכנולוגיה שמאפשרת למדען לחתוך, כמעט בכל מקום, מולקולות DNA בתאים חיים.

מה עושים עם זה?

בשלב הראשון, אפשר למחוק פשוט כל גן שנרצה.

בשלב הבא? ניתן להדביק איפה שחתכנו רצף גנטי חדש (בהסתמך על מנגנוני תיקון DNA שכבר קיימים בתא). זה נותן בתכל'ס למדען את היכולת לערוך מידע גנטי כרצונו. מאז שהטכנולוגיה הומצאה לפני כשש שנים, פותחו מגוון רחב של וריאציות עליה אשר מרחיבות אף יותר את ארגז הכלים של החוקרים.

מה שיפה בטכנולוגיה זה שהעריכה גנטית באמצעות קריספר עושה שימוש בכלים הכי בסיסיים של ביולוגיה מולקולרית. אז אמנם זה עדיין לא ברמה שכל אחד יכול לשחק עם קריספר במטבח שלו. אבל זה כן ברמה שבכל מעבדה ביולוגית הכי בסיסית ניתן לבצע עריכה גנטית עם קריספר.

אלה כלים שיכולים להיות נגישים גם לחובבי ביולוגיה מחוץ לאקדמיה, שיקימו לעצמם מייקרספייס ביולוגי.

הטכנולוגיה אומצה מהר מאוד גם בגלל הנגישות הגבוהה שלה וגם בגלל שהיא מספקת לחוקרים כלים שלא היו בידיהם קודם.

בעולם המחקר האקדמי הפירות שלה כבר מורגשים בכל מקום. הפוטנציאל ברפואה ובביוטכנולוגיה הוא עצום, אבל על כך בהמשך.

קריספר: סיפור מקור
כמו מערכות אחרות שמשמשות להנדסה גנטית, גם מערכת זו מקורה מסוג של מערכת חיסונית של חיידקים.

חיידקים יכולים להיות מותקפים על ידי וירוסים כמעט כמונו (לוירוסים שתוקפים חיידקים קוראים "בקטריופאג'ים", או בקיצור "פאג'ים"). לכן החיידקים פיתחו מערכות הגנה שונות להילחם בפאג'ים.

פאג' הוא אורגניזם מאוד קומפקטי ופשוט. אפשר לדמיין אותו כקופסה קטנה המכילה מידע גנטי השמור במולקולת DNA, וזהו. מה שאומר שהדרך להרוג אותו היא לחתוך את ה-DNA שלו. כך יצא שמערכות הגנה חיידקיות היוו את הבסיס להרבה מטכנולוגיות העריכה הגנטית; הן פשוט התפתחו במהלך האבולוציה כדי להיות ממש טובות בלחתוך DNA.

אבל הסיפור של קריספר מתחיל עוד מלפני שזיהו שזוהי מערכת חיסונית, והרבה לפני שמישהו דמיין בכלל שזה יהווה את הבסיס לטכנולוגיה שתשנה את העולם.

לראיה, שימו לב לפירוש ראשי התיבות של השם:

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)

הרי אם מישהו היה מדמיין כמה משמעותית תהיה המערכת הזו הוא בטח היה חושב על שם קצת פחות מסובך וקריפטי, נכון?

הסיפור מתחיל בתחילת שנות ה90 כאשר חוקרים בספרד, יפן, והולנד (במקביל) זיהו בגנום של חיידקים מבנה מוזר של רצפים פלינדרומיים קצרים שחוזרים על עצמם, וביניהם מרווחים שנראים אקראיים (ומכאן אותו שם ארוך).

עד שנת 2005 לערך, זה היה ממצא נישתי במיוחד שעניין מספר בודד של חוקרים שהתעסקו בגנטיקה של חיידקים. עד שבשנים 2005-2007 בעקבות התפתחויות טכנולוגיות בריצוף גנטי הצליחו חוקרים להבין שהתופעה המוזרה הזו בגנום החיידקי היא למעשה סוג חדש של מערכת חיסונית חיידקית נגד פאג'ים.

בעצם, לא סתם מערכת חיסונית – מערכות אחרות כאלה כבר היו מוכרות היטב. מה שמיוחד בקריספר הוא שזוהי מערכת חיסונית נרכשת. כאשר חיידק פגש בפאג' ושרד כדי לספר לחבר'ה, הוא "זכר" חתימה גנטית של הפאג' הזה ויצר יכולת להתגונן כנגד התקפות עתידיות שלו (החתימות אלה הן אותן מקטעים שנראו אקראיים בתחילה).

מציאה של מערכת חיסונית חדשה בחיידקים כבר היתה תגלית יותר מרעישה, גם משום הסקרנות המדעית הבסיסית, וגם משום שכפי שכבר ציינתי מערכות הגנה של חיידקים הן בסיס מצויין לכלים חדשים להנדסה גנטית.

מפה החל מירוץ לאפיון והבנה של המערכת הזו. סופו בפרסום ראשון ב-2012 על מערכת עריכה גנטית מבוססת קריספר אשר עובדת בחיידקים (מאת חוקרות מאוניברסיטת ברקלי בקליפורניה, ואוניברסיטת אומאו בשוודיה). חצי שנה לאחר מכן, ב-2013, פורסמו במקביל שני מאמרים שיישמו מערכת זו בתרביות תאים אנושיים (מאת חוקרים מהרווארד ו-MIT).

זה המקור למאבק משפטי שמתנהל על הפטנט. האם הראשונים שיישמו את הטכנולוגיה בתאים אנושיים יקבלו את הפטנט? או שזה היה צעד טריוויאלי שנבע מפיתוח הטכנולוגיה בתאים חיידקיים?

איך קריספר עובד בפועל?
כל מערכת קריספר מורכבת משני חלקים.

חלק אחד הוא מקטע של רצפים פלינדרומיים, וביניהם חלקים קצרים של בערך 20 בסיסים (כלומר, "אותיות" ברצף הגנטי). לרצפים של הבסיסים האלה קוראים "ספייסרים" (כי הם יוצרים "רווח" בין הפלינדרומים).

החלק השני הוא קבוצה של גנים שמקודדים לחלבון. הם מהווים את מערכת קריספר ומכונים CRISPR Associated Systems, או בקיצור CAS.

כאשר חיידק פוגש לראשונה פאג' חדש ומצליח איכשהו להתגבר עליו, חלק מחלבוני ה-CAS חותכים חתיכה של כ-20 בסיסים מה-DNA של הפאג' ומכניסים אותה כספייסר חדש לאותו מערך של ספייסרים. בפעם הבאה שפאג' מאותו סוג תוקף את החיידק, חלבון בשם CAS9 מתביית על ה-DNA שלו, וחותך אותו במקום בו הרצף זהה לרצף שנשמר כספייסר בפעם הקודמת.

בעצם, מה שהחוקרות שהזכרתי למעלה עשו כשהן רתמו את המערכת הזו עבור כלי לעריכה גנטית, זה להשתמש ב-CAS9, ובנוסף לייצר מולקולת RNA שמחקה את התוצר המעובד הסופי שנוצר מהספייסר. למולקולה הזו הם קראו single guide RNA או בקיצור sgRNA. באותו sgRNA מכניסים את אותן 20 אותיות וזהו החלק אשר מדריך את ה-CAS9 לחתוך במקום הרצוי.

מה עושים עם כל זה?
כל פעולת המערכת שתוארה למעלה, מתרחשת בתוך תא שלם וחי. עד לקריספר חוקרים ידעו לבצע כל מיני חיתוכים ועריכות לDNA אבל רק כשהוא במבחנה מחוץ לתא חי. בעקבות קריספר ניתן להנדס תאים חיים בפשטות ובמהירות ולהמשיך לבצע בהם ניסוי.

לכן, השימוש הראשון שעשו בטכנולוגיה היה לקחת אוסף גדול של תאים מתרבית, ולמחוק בהם בצורה סיסטמטית – בכל תא – גן אחר מהגנום האנושי. אחר כך בדקו איך המחיקה משפיעה על התא.

מחיקת גנים היא כמעט מיידית כתוצאה מהפעולה של CAS9 משום שהוא יכול לחתוך את ה-DNA באמצע הגן. כך הצליחו לפענח מה היא הפונקציונליות של גנים שפעולתם לא היתה ידועה עד אז.

השימוש השני בקריספר הוא עריכה. כלומר, להחליף רצף אחד ברצף אחר. עושים את זה עם ניצול מנגנוני התיקון הטבעיים של התא. אם בנוסף לקריספר מכניסים לתא גם עותק של ה-DNA שרוצים להכניס פנימה, בחלק מהמקרים מנגנוני תיקון ה-DNA יתקנו את החתך באמצעות הכנסה פנימה של העותק החלופי.

פעולה זו מתבצעת ביעילות נמוכה יותר מפעולת המחיקה, אך על ידי ברירה של התאים בסוף התהליך ניתן לבחור את התאים בהם בוצעה ההחלפה. פעולת העריכה מעוררת תקווה שאולי בעתיד ניתן יהיה באמצעותה לרפא מחלות אשר כבר היום אנחנו יודעים שנגרמות כתוצאה ממוטציה בודדת במקום ידוע (לדוגמה, אנמיה חרמשית, סיסטיק פיברוזיס, האנטינגטון, ועוד).

מה צופן העתיד?
כבר שש שנים שאנחנו משתמשים בקריספר, ויש כיום סט כלים רחב ועשיר לטכנולוגיה. ואם עוקבים אחר הז'ורנלים המדעיים, נדמה כי בכל חודש ממציאים וריאנט אחר של קריספר.

את ההמצאות החדשות עושים או עם עריכה והנדסה של החלבונים המוכרים של קריספר. או מצד שני, על ידי חיפוש מערכות קריספר חדשות.

יש המון מינים שונים של חיידקים, וכולם צריכים להתגונן מפני פאג'ים. אז לאחר שגילו את העקרונות הבסיסיים של המערכת החיסונית הזו, מצאו עוד סוגים של מערכות קריספר בחיידקים אחרים. כל מערכת כזו פועלת בצורה קצת שונה. לאחר שחוקר אחד מאפיין תת מערכת חדשה של קריספר ואת הפעולה שלה, מהר מאוד יבוא חוקר אחר וימצא כיצד לרתום אותה לצרכים טכנולוגיים.

מגוון היישומים הנוספים שניתן לעשות עם קריספר הוא רחב. מלבד מחיקה ועריכה של גנים, קיימות כבר יכולות נוספות אשר המשותף לכולם הוא שימוש ביכולת של קריספר להתביית על איזור מסוים ב-DNA. למשל, הפעלה או השתקה של גנים באופן ייזום (לא לפי תוכנית הבקרה הטבעית שלהם), מערכת זולה ומדויקת לזיהוי נגיפים, הפצת יתושים עמידים למלריה, אשר מפיצים במהירות את העמידות לכל האוכלוסיה
אז מה צופן העתיד? האם קריספר הולך לפתור אותנו מכל המחלות, בו בזמן שהוא יסייע לנבל-על כלשהוא לייצר חיילי על?! התשובה היא לא!

בעיות עם קריספר
יש עוד הרבה אתגרים עד שנשתמש בטכנולוגיה לערוך גנטית בני אדם (מלבד הבעיות האתיות).

בעיה אחת, למשל, היא שהמערכת אכן מתבייתת במדוייק על אותה כתובת בת 20 אותיות, אבל מסתבר שבנוסף – בהסתברות נמוכה יותר – היא יכולה להתביית גם על מטרות אחרות. אם זה יגרום ל-DNA להיחתך במקום לא רצוי, התוצאות יהיו בלתי צפויות וכנראה לא נעימות בכלל.

כרגע השימוש בקריספר עוד לא בטוח מספיק לבני אדם. אבל אחד הכיוונים בהם חוקרים עובדים הוא לשפר את הדיוק של המערכת ולהקטין משמעותית את הפספוסים שלה.

כך או כך, כבר כיום, שנים ספורות מאז ההמצאה, השימוש בקריספר שינה מקצה לקצה את הדרך בה חוקרים בביולוגיה עובדים. כבר התחילו להופיע בשוק תוצרים חקלאיים שנערכו גנטית באמצעות קריספר, ובכל תחום ביוטכנולוגי מדענים ומהנדסים משתמשים בקריספר כדי לממש את החלומות הפרועים שהיו להם. ברפואה פרופר כנראה עוד יעבור זמן עד שנראה רפואה גנטית מבוססת קריספר, אבל אני מניח שגם יום זה יגיע, ולא עוד המון זמן.

אין ויכוח שיוענק פרס נובל על המצאת קריספר. יש אפילו שצופים שיוענקו שני פרסים במקביל – אחד בכימיה ואחד ברפואה – כדי לפתור את המחלוקת של "מי המציא את קריספר?"

— אם קצת התבלבלתם, אז הנה סרטון של 7 דקות שמסביר על קריספר גראפית —